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                无菌检查法-2015版中国药典



                录入时间:2014-9-15 14:35:19 来源:国家药典委员会

                无菌检查法系用于检查药■典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微】生物污染。
                    无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部◥A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微ㄨ生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室『(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行▓洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日◥常检验还需对试验环境进行监控。
                    无菌检查人员必须具备微生物专业№知识,并经过无菌技术的培训。
                    培养基
                    硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养,也可用于需气菌培养;胰酪大豆胨♂液体培养基适用于真菌和需气╱菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备,亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基█。配制后应采用验证合格的灭菌程序〒灭菌。制备好的培养基≡应保存在2~25℃、避光的环境,若保存于非密闭容器中,一般在3周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在一年内使用→。

                1. 硫乙醇酸盐流体培养基
                酪胨 (胰酶水解) 15.0g     酵母浸出粉 5.0g
                葡萄糖 5.0g               氯化钠 2.5g
                L-胱氨酸 0.5g             新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml
                硫乙醇▼酸钠 0.5g           琼脂 0.75g
                (或硫乙醇酸) ( 0.3 ml)   纯化水 1000ml

                除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成√分混合,微温溶解,调节pH 为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青溶液,摇匀,调节pH 值使灭菌≡后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的¤比例应符合培养结束后培2养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培▲养基深度的1/5,否则,须经100℃水浴加热至粉红色消失(不超过20 分钟),迅速冷却,只限加热一次,并防止被污染。除另有规∮定外,硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃培养。
                    2. 胰酪大Ψ豆胨液体培养基
                胰酪胨 17.0g                            氯化钠 5.0g
                大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g               磷酸氢二钾 2.5g
                葡萄糖(一水合/无水) 2.5g (2.3g)     纯化水 1000mL
                除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,调节pH 值使灭菌々后在25℃的pH 值为7.3±0.2,加入葡萄糖,分装,灭菌。胰酪大№豆胨液体培养基置20~25℃培养。
                    3. 选择性培养基
                    按上述硫◣乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入适╳宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂,其用量同方ξ 法适用性试验。
                    4. 0.5%葡萄糖●肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检≡查)
                胨 10.0g              氯化钠 5.0g
                葡萄糖 5.0g           水 1000 ml
                牛肉◥浸出粉 3.0g
                    除葡萄糖外,取上㊣述成分混合,微温溶解,调节 pH 为弱碱性,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节 pH 值使∮灭菌后在25℃的pH 值为7.2±0.2,分装,灭菌。
                    5. 胰酪大♀豆胨琼脂培养基
                胰酪胨 15.0g                 氯化钠 5.0g
                大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g    琼脂 15.0g
                纯化水 1000ml
                    除琼脂外,取上述成分,混合。微温溶解,调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶★化后╳,摇匀,分装,灭菌。
                    6.沙氏葡萄糖液体培养基
                动物组织胃蛋白酶水♂解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
                葡萄糖 20.0g   纯化水 1000mL
                    除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为5.6±0.2,加入葡萄糖,摇匀,分装,灭菌。
                    7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基
                动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
                葡萄糖 40.0g 纯化水 1000mL
                琼脂 15.0g
                    除葡萄糖、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2,加入琼脂,加热溶化后, 再加入葡萄糖,摇匀,分装,灭菌。
                    培养基的适用性检查
                    无菌检查用的▂硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基ㄨ等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
                无菌性检查 每批培养基随机取不少∮于5 支(瓶),置各培养基规定的温度培养14 天,应◣无菌生长。
                    灵敏度检查
                    菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得★超过5 代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代),并采用适〓宜的菌种保存技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
                金黄色☆葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
                铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
                枯草芽孢杆№菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕
                生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
                白※色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
                黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
                    菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养▽基中或胰酪大豆胨琼脂培↓养基上,接种∑生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24 小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养↘基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上,20~25℃培养24~48 小时,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100CFU(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉╱的新鲜培养 物至沙氏葡萄糖琼脂斜面△培养基上,20~25℃培养5~7 天,加入3~5ml 含0.05%(v/v)聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适㊣宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(v/v)聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于100CFU 的孢子悬←液。
                菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用,若保存在2~8℃可在24 小时内使用。黑曲』霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。
                    培养基接种  取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培△养基7 支,分别接种小于100CFU 的金黄色●葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支,另1 支不←接种作为空白对照,培养3 天;取每管装量为9ml 的胰酪大豆☉胨液体培养基7 支,分别接种小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支,另1 支不接种作为空白对照,培养5 天。逐日∏观察结果。
                    结果判定 空白对照@管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。
                    稀释液、冲洗液及其制备⊙方法
                    稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
                    1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,调节pH 值至7.1±0.2,分装,灭菌。
                    2.pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g,磷酸氢二钠7.23g,氯化钠4.30g,蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,分装,灭菌。
                    3. 根据供试品的▽特性,可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液(如0.9%无菌氯化钠溶液)。
                如需要,可在上述稀释∩液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
                    方法适用性试验
                    当进行产品无菌检查法时,应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合〒于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,应重新进行方法适用性试验。
                    方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行◥方法确认。
                    菌种及菌液制备 除大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 4 4102〕外,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
                    薄膜过滤法 取每种培养基▲规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌,过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器◣,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度↘培养3~5 天,各试验菌同法操作。
                    直接接种法 取符〓合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6 管,分别接》入小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管,取符合直接接种法培养基用量要求的@ 胰酪大豆胨液体培养基6 管,分别接入小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培养基规定的供试品接↘种量,另1 管作为对照,置规定的温度Ψ 培养3~5 天。
                    结果判断 与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试▃品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可々以忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器〇中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量、增加培养基的▲用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种◥等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法适用性试验。
                    方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
                    供试品的无菌检查
                    无菌检查法包括薄膜过滤法和直ξ接接种法。只要供试品性质允许,应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采●用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的∞方法相同。
                    无菌试验过程中,若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂,应证明其有效性,且对微生物◆无毒性。
                    检验数量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外,出厂ξ产品按表1 规定;上市产品监督检验按表2 规定。表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照ζ 试验的供试品用量。
                    检验量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养〓基的最小量(g 或ml)。除另有规定外,供试品︼检验量按表3 规定。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两☆种培养基,则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时,只要供试品特性允许,应将所有容器内的全『部内容物过滤。
                    阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌:无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照ξ 菌;抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对◇照菌;抗厌氧菌的供试品,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品,以白色√念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验,加菌量小于100CFU,供试品用量同供试品无菌︽检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培『养48~72 小时应生长良好。
                    阴性对照 供试品无菌检查时,应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作,作为阴性对照◇。阴性对照不得有菌生◢长。
                    供试品处理及接种培养基
                    操作时,用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒,如果供试品容器内有一定的真空度,可用适宜的无菌器材(如带有ω 除菌过滤器的针头)向容〓器内导入无菌空气,再按无菌操作启开容器取出内容物。除另有规定外,按下列方法进行供试︽品处理及接种培养基。
                    1.薄膜过滤法
                    薄膜过滤¤法应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜ξ的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完』整性。
                    水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供》试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意▅保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml,且总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。
                    水溶液供试品 取规定量,直接过滤,或混合至含不少于100ml 适宜稀释液的无菌容器中,混匀,立即过滤。如供试品具有抑菌╲作用,须用冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数一般不少于三次,所用▅的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。除∏生物制品外,一般样品冲洗后,1 份滤器加╱入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基,1 份滤器加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基。生物制品样品冲洗后, 2 份滤器加入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基,1 份滤器加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基。
                    水溶性固体⊙供试品 取规定量,加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶,然后照水溶液供试品项下的方法操作。
                    非水溶性供□试品 取规定量,直接过滤;或混合溶于适量含聚山梨酯80或其㊣ 他适宜乳化剂的稀释液中,充分混合,立即过滤。用含0.1~1%聚山梨酯80 的冲洗液冲洗滤膜至少3 次。加入含或不含聚山梨酯80 的培养基。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
                    可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品 取规定量,混合至适量的卐无菌十四烷酸异丙酯①中,剧烈振摇,使供试品充分溶解,如果需要可适当加热,但温度不得超→过44℃,趁热迅速过∑滤。对仍然无法过※滤的供试品,于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml 的稀释液,充分振摇萃取,静置,取下层水相作为供试液「过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
                    无菌气(喷)雾剂供试品 取规定量,将各容器置-20℃以下的冰卐室冷冻约1 小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔,释放↑抛射剂后再无菌开启容器,并将供试液转移至无菌容器中,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
                    装有药物的注射器◣供试品 取规定量,将注射器中的内容物(若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解)直接过滤,或混合至含适宜稀释液的无菌容器中,然后按水溶液或非水溶性供试品项下方法操作。同时应采用适宜的方法进行包装中所∏配带的无菌针头的无菌检查。
                    具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品 取规定量,每个最小包装用50~100ml 冲洗液分︾别冲洗内壁,收集冲洗↑液于无菌容器中,然后々照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。
                    2. 直接接种法
                    直接接种法适用ζ于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品,即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品①外,一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等;生物制品无菌检查时硫乙◤醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2:1。除另有规定外,每个容器中培养基的用量应符合接种的∞供试品体积不得大于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时,培养基的用量和高度同方法适用性试验。
                    混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量,等量接种至各管培养基中。
                固体供试品 取规定量,直接等量接种至各管培养基中。或◤加入适宜的溶剂溶解,或按标签说明复溶后,取规定量等量接种至各管培养基☆中。
                    非水溶性供试品 取规定量,混合,加入适量的聚山梨酯80 或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化,等量接种至各管培养基中。或』直接等量接种至含聚山梨酯80 或其它适宜乳化剂的各管培养基中。
                敷料供试品 取规定数量,以无菌操作拆开每↓个包装,于不同部位剪取约100mg 或1cm×3cm 的供试品,等量接种于各①管足以浸没供试品的适量培养基中【。
                    肠线、缝合线等供试品 肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装,无菌拆开※包装,等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
                    灭菌医用器具供试品 取规定量,必要时应将其拆散或切成小碎段,等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
                    放射性药品 取供试品1 瓶(支),等量接种于装量为7.5ml 的硫乙醇酸流液体培养①基和胰酪大豆胨液体培养基中。每管接⌒种量为0.2ml。
                    培养及观察
                    将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天;接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应」分成两等份,一份置30~35℃培养,一份置20~25℃培养。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14 天后,不能从外观【上判断有无微生物生长,可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中,培养3 天,观察接种的同种新鲜培养基是否↓再出现浑浊;或取培养液涂片,染色,镜检,判断是否有菌。
                    结果判断
                阳性对照管应生长良好,阴性对照㊣ 管不得有菌生长。否则,试验无效。若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规〖定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符⌒ 合规定,除非能充分证明试〖验结果无效↑,即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效:
                (1)无菌检查试验所用的设备及环境★的微生物监控结果不符合『无菌检查法的要求。
                (2)回顾无菌试验过程,发现有可能引起微生物污染的因素。
                (3)供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无△菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。
                    试验若经确认无效,应重试。重试时,重新取同量供试品,依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定;若有菌生长,判供试品不符合规定。

                 
                表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数〓量

                批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量

                    注:若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍

                 

                表2. 上市抽验样品的∩最少检验数量

                上市抽验样品的最少检验数量


                    注:1.若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。
                        2.抗生素粉针剂(≥5 克)及抗生素原∑ 料药(≥5 克)的最少检验☉数量为6 瓶(或支)。桶装固体原▼料的最少检验数量为4 个包装。

                表3. 供试品的最少检验量

                供试品的最少检验量

                    注:① 如果医用器械体积过大,培养基用量可【在2000ml 以上,将其完全浸没。

                 

                    说明:
                    1.无菌检查法收载于《中国药典》一、二、三部附录中,一部和二部⊙内容一致。
                    2.本稿以2010 年版二部的“无菌检查法”为基础进行中的内容进行一、二及三部内容的整合,并进行了修订。
                    3..整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点,如检验∴数量、硫乙醇酸盐培养基接种份数和培养温度等。
                    4..修订稿中检验环境修订为“B 级背景下的A 级”。
                    5.改良①马丁培养基修订为“胰酪大豆胨液体培养基”。
                    6.方法验证试验修订为方法适♂用性试验。
                    7.由于培养基的改变,培养基的灵敏度和方法适用性试验也进ㄨ行了修订。
                    8.修订了表1、表2、表3 的内容。

                 

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